2、結(jié)果與討論

2.1β-甘露聚糖酶產(chǎn)生菌的篩選

以瓜爾膠為唯一碳源，不能利用瓜爾膠產(chǎn)生β-甘露聚糖酶的菌株就逐漸成為弱勢(shì)菌群從而被淘汰。利用高通量篩選方法從樣品中共篩選得到571株產(chǎn)β-甘露聚糖酶菌株，通過(guò)DNS法分別測(cè)定其所產(chǎn)β-甘露聚糖酶的酶活力，測(cè)定結(jié)果如表1所示，其中有40株菌株所產(chǎn)酶的酶活力較高。對(duì)這40株菌株進(jìn)行100 mL體系擴(kuò)大培養(yǎng)，分別在5和20℃下測(cè)定瓜爾膠溶液的粘度，發(fā)現(xiàn)其中6株菌株所產(chǎn)酶的低溫降粘速度較快，分別編號(hào)為A2、O5、L10、H13、Q12和Q14，如圖1所示。綜上可知，菌株O5所產(chǎn)β-甘露聚糖酶的酶活力最高，達(dá)到208.9 U/mL；在5和20℃下降低瓜爾膠的粘度也是最快的。菌株O5經(jīng)剛果紅染色后，產(chǎn)生了明顯的透明圈（圖2A）；經(jīng)100 mL體系發(fā)酵培養(yǎng)48 h后，可將1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的瓜爾膠幾乎降解完全，培養(yǎng)基的粘度明顯降低，從815.8 mPa?s降低至67.2 mPa·s，降粘率大于90%（圖2B），說(shuō)明其中必然存在著降解瓜爾膠的微生物。因此，進(jìn)一步對(duì)菌株O5進(jìn)行形態(tài)觀察和種屬鑒定及后續(xù)研究。

表1已分離的40株菌所產(chǎn)β-甘露聚糖酶的酶活力

圖1不同時(shí)間下瓜爾膠溶液的粘度

圖2菌株O5的剛果紅染色（A）及降解瓜爾膠特性（B）

2.2菌株O5的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定如圖3所示，菌株O5在LB平板上呈灰綠色，表面光滑隆起，邊緣不整齊；革蘭氏染色鑒定為陰性；經(jīng)掃描電子顯微鏡觀察得，菌株O5為桿狀菌，菌體長(zhǎng)為1.5~2.0μm，寬為0.3~0.4μm。

圖3菌株O5的形態(tài)學(xué)觀察

利用16S rRNA基因測(cè)序?qū)闛5進(jìn)行鑒定，將測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)菌株O5與假單胞菌的同源性最高，為99.87%。利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4）。由圖4可知，菌株O5和施氏假單胞菌Pseudomonas stutzeri M16-9-4位于進(jìn)化樹(shù)的同一分支中，親緣關(guān)系最相近。綜合形態(tài)特征鑒定，鑒定菌株O5為施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri），命名為Pseudomonas stutzeri O5。

圖4基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3β-甘露聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)

菌株在含有甘露聚糖的固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，被誘導(dǎo)產(chǎn)生β-甘露聚糖酶后，會(huì)將菌落周?chē)亩嗑厶墙到鉃楣烟?，?jīng)過(guò)剛果紅染色后產(chǎn)酶菌株的菌落周?chē)蜁?huì)產(chǎn)生清晰的透明圈，通過(guò)這種方法可以比較直觀的觀察菌株是否產(chǎn)β-甘露聚糖酶。但酶活力大小與透明圈的大小之間并不是嚴(yán)格的比例關(guān)系，故采用DNS法測(cè)定其產(chǎn)酶的酶活力大小。菌株O5在瓜爾膠固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，經(jīng)剛果紅染色后產(chǎn)生了明顯的透明圈；且其只有在以甘露聚糖類(lèi)物質(zhì)為底物時(shí)才有還原糖的產(chǎn)生，以瓜爾膠為底物時(shí)，比活為347.4 U/mg，當(dāng)以葡聚糖、果膠等為底物時(shí)，并沒(méi)有測(cè)到酶活力，由此確定菌株O5所產(chǎn)酶為β-甘露聚糖酶ME-O5（ME-O5）。

溫度對(duì)酶活力的影響如圖5A所示。ME-O5的最適反應(yīng)溫度為50℃。據(jù)報(bào)道，大多數(shù)β-甘露聚糖酶的最適溫度在40~65℃之間，低于或高于最適溫度下大多數(shù)酶均不穩(wěn)定，但其失活的速率不同。ME-O5在20~70℃范圍內(nèi)的相對(duì)酶活力均在80%以上，能夠保持較高的酶活力；當(dāng)溫度超過(guò)70℃時(shí)，酶活力快速降低；當(dāng)溫度小于20℃時(shí)，酶活力雖然有所下降，但相對(duì)酶活力仍保持在60%以上。值得注意的是，在5、10和20℃下ME-O5分別具有約60%、約72%和約80%的相對(duì)酶活力。由此可見(jiàn)，ME-O5的溫度作用范圍廣，低溫下酶活力高。

圖5溫度、pH值對(duì)β-甘露聚糖酶酶活力及穩(wěn)定性的影響

與已報(bào)道的一些低溫酶相比，ME-O5在低溫下能保持更高的相對(duì)酶活力。Zhou等從磷石礦渣中分離得到Sphingomonas sp.JB13，其所產(chǎn)的β-甘露聚糖酶的最適溫度為40℃，在20℃時(shí)的相對(duì)酶活力約為55%，在10℃時(shí)約為20%。Huang等分離到一株高產(chǎn)β-甘露聚糖酶的Bacillus subtilis Bs5，其所產(chǎn)酶的最適溫度為35℃，在20℃時(shí)能保持40%的相對(duì)酶活力。Pongsapipatana等從Klebsiella oxytoca KUB-CW2-3中克隆了β-甘露聚糖酶的編碼基因，并通過(guò)大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)，得到甘露聚糖酶KMAN-2，其最適溫度為30~50℃，在30℃時(shí)的相對(duì)酶活力約為60%。

由圖5B可知，ME-O5在60℃熱處理1 h，其殘余酶活力保持在90%以上，具有良好的穩(wěn)定性；但隨著溫度的升高，酶活力穩(wěn)定性迅速下降，在70℃處理1 h，其酶活力保持在60%以上；當(dāng)ME-O5在80℃時(shí)熱處理30 min，能保持高于50%的酶活力，隨著熱處理時(shí)間的增加，酶活力繼續(xù)下降，處理1 h時(shí)僅能維持大約20%的酶活力。由此可知，ME-O5在中溫區(qū)域的熱穩(wěn)定性良好，但在高溫區(qū)域（80℃以上）的熱穩(wěn)定性相對(duì)較差。

圖5C是不同pH值條件下ME-O5的相對(duì)活性，結(jié)果表明，ME-O5的最適pH=7.0。當(dāng)pH值在2.0~7.0時(shí)，隨著pH值增大，ME-O5的相對(duì)酶活力增加，在pH=2.0時(shí)仍能保持43%的相對(duì)酶活力；當(dāng)pH值在7.0~12.0時(shí)，隨著pH值的繼續(xù)增大，ME-O5的相對(duì)酶活力逐漸降低。但pH值在3.0~9.0范圍內(nèi)，ME-O5均能夠維持70%以上的酶活力，具有一定的pH值適應(yīng)性和較寬的pH值耐受范圍。

將ME-O5分別與不同pH值的緩沖液混合，在50℃下孵育2 h，再與瓜爾膠底物溶液在最適條件下反應(yīng)，測(cè)定其殘余酶活力，結(jié)果如圖5D所示。由圖可知，ME-O5在pH值4.0~7.0范圍內(nèi)處理2 h，其殘余酶活力均能保持在80%以上，說(shuō)明該酶在弱酸條件下能夠保持較高的酶活力且相對(duì)穩(wěn)定。當(dāng)pH值在8.0~9.0之間時(shí)，處理2 h仍能保持65%以上的殘余酶活力，ME-O5的pH值穩(wěn)定性良好。

2.4低溫條件下ME-O5對(duì)瓜爾膠的降解

ME-O5對(duì)瓜爾膠的降粘結(jié)果如圖6所示。在20℃條件下，ME-O5可使粘度超過(guò)1000 mPa·s的瓜爾膠溶液在3 h內(nèi)粘度降低至5 mPa·s以下，使其粘度降低99%以上，在降低瓜爾膠粘度上表現(xiàn)優(yōu)異；在5℃時(shí)，雖然降粘速度有所下降，但仍可在3 h內(nèi)將粘度超過(guò)1000 mPa·s的瓜爾膠溶液的粘度降至100 mPa·s以內(nèi)，在6 h內(nèi)粘度降低至5 mPa·s以下，而空白組中的瓜爾膠溶液仍保持高粘度。由此可知，ME-O5表現(xiàn)出優(yōu)良的低溫降解瓜爾膠特性，能在短時(shí)間少用量的情況下，降解大量瓜爾膠底物，5℃時(shí)3 h內(nèi)能使瓜爾膠溶液的粘度降低90%以上，降粘效果顯著。You等研究發(fā)現(xiàn)來(lái)源于Enterobacter sp.N18的β-甘露聚糖酶在40℃時(shí)，3 h內(nèi)可以將粘度大于1000 mPa·s的壓裂液的粘度降低到5 mPa·s以下。Li等從Bacillus subtilis TD7中分離出一種低溫β-甘露聚糖酶（YBMan），并在大腸桿菌中成功表達(dá)，在20℃時(shí)YBMan能在3 h內(nèi)將瓜爾膠溶液的粘度從500 mPa·s降低到5 mPa·s以下。相較而言，ME-O5在低溫下降解瓜爾膠更有優(yōu)勢(shì)，因此在以瓜爾膠為稠化劑的壓裂液中，進(jìn)一步探究ME-O5作為酶破膠劑的破膠性能。

圖6 5、20℃時(shí)瓜爾膠溶液的粘度變化

2.5 ME-O5的破膠效果

2.5.1 ME-O5與水基壓裂液添加劑的配伍性

在壓裂過(guò)程中選擇生物酶作為破膠劑，必須要保證酶與不同壓裂液添加劑間的配伍性。按1.2.7小節(jié)中壓裂液配方，將ME-O5分別與只含有KCl、Na2CO3、NaHCO3、戊二醛、硼砂和瓜爾膠添加劑的瓜爾膠溶液混合，破膠3 h后測(cè)定其破膠液的粘度。ME-O5在不同壓裂液添加劑下的破膠情況如表2所示。由表2可知，各種壓裂液添加劑與ME-O5均沒(méi)有配伍禁忌，3 h后破膠液的粘度均下降至5 mPa·s以內(nèi)，具有良好的配伍性。

表2 ME-O5與不同壓裂液添加劑的配伍性

水基壓裂液是由多種不同的添加劑按比例配成的非均質(zhì)不穩(wěn)定化學(xué)體系。隨著壓裂技術(shù)的不斷發(fā)展，壓裂液體系也在不斷優(yōu)化。在實(shí)際的壓裂施工中，水基壓裂液的配方由于施工環(huán)境的不同，存在著較大的差異。本壓裂液配方選擇油田中常用的瓜爾膠作為稠化劑；選擇硼砂作為交聯(lián)劑；為了穩(wěn)定粘土礦物，選擇KCl作為粘土穩(wěn)定劑，以減少粘土礦物等對(duì)儲(chǔ)層滲透率造成的傷害；為了使壓裂液的性能更加穩(wěn)定，便于控制，還加入了一定量的Na2CO3和NaHCO3，作為pH調(diào)節(jié)劑。此外，從低成本的角度考慮，選擇戊二醛為殺菌劑，用來(lái)防止細(xì)菌滋生。

2.5.2粘度變化

按照配方配置壓裂液，壓裂液凍膠初始粘度為大于1000 mPa·s，加入1%（體積分?jǐn)?shù)）的ME-O5，在不同溫度下分別恒溫反應(yīng)3和6 h后測(cè)得其破膠液的粘度如圖7所示。破膠3 h時(shí)，在10~60℃范圍內(nèi)，ME-O5均可將壓裂液粘度降至5 mPa·s以下，徹底破膠（室溫測(cè)定破膠液粘度低于5 mPa·s時(shí)視為徹底破膠）；但當(dāng)溫度在10℃以下或60℃以上時(shí)，酶的活性受到了影響，未能在3 h內(nèi)破膠。當(dāng)破膠時(shí)間延長(zhǎng)到6 h時(shí)，在5~70℃內(nèi)，壓裂液能徹底破膠。由此表明ME-O5的在中低溫范圍內(nèi)破膠效果好，在很大程度上彌補(bǔ)了化學(xué)破膠劑的破膠效果在低溫時(shí)受到限制的問(wèn)題。

圖7不同溫度下壓裂液粘度隨時(shí)間的變化

2.5.3表/界面張力及殘?jiān)?

在水力壓裂過(guò)程中，僅壓裂返排液的粘度低不能說(shuō)明裂縫中的壓裂液已返排干凈，要綜合考慮其破膠性能。壓裂液在10、20和50℃條件下破膠3 h后，破膠液的表面張力、界面張力和殘?jiān)康臏y(cè)定結(jié)果如表3所示。由表中數(shù)據(jù)可知，無(wú)論是在10、20還是50℃條件下，破膠液的表面張力均小于28 mN/m，界面張力均小于2 mN/m，殘?jiān)烤∮?00 mg/L，達(dá)到或優(yōu)于我國(guó)石油天然氣行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SY/T 6376-2008《壓裂液通用技術(shù)條件》的要求，SY/T 6376-2008中關(guān)于破膠性能的各項(xiàng)指標(biāo)分別為：破膠時(shí)間≤720 min，破膠液表觀粘度≤5.0 mPa·s，破膠液表面張力≤28.0 mN/m，破膠液與煤油界面張力≤2.0 mN/m，殘?jiān)俊?00 mg/L。這充分說(shuō)明ME-O5在低溫下的破膠效果良好，在低溫油田壓裂破膠方面表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。

表3破膠液的評(píng)價(jià)

3、結(jié)論

低溫酶破膠劑對(duì)頁(yè)巖油氣藏開(kāi)發(fā)過(guò)程中返排液的破膠及低溫油藏壓裂液的破膠至關(guān)重要。為此，本研究從油田壓裂返排水和魔芋田地的混合樣品中成功篩選到一株產(chǎn)低溫β-甘露聚糖酶的菌株O5，其所產(chǎn)β-甘露聚糖酶（ME-O5）的最適溫度為50℃，最適pH=7.0，對(duì)環(huán)境溫度和酸堿度的耐受范圍廣；在5~20℃時(shí)仍能保持約60%以上的酶活力，低溫活性優(yōu)異。ME-O5與壓裂液各添加劑的配伍性良好，在10、20和50℃下均能徹底破膠，殘?jiān)?，具有良好的低溫破膠性能。ME-O5作為酶破膠劑具有專(zhuān)一性強(qiáng)、溫度和pH作用范圍寬、低溫活性高等優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了化學(xué)破膠劑在低溫下破膠效果差的弊端，在低溫破膠領(lǐng)域有良好的應(yīng)用潛力；且ME-O5可以快速降低壓裂返排液的粘度，減少對(duì)自然環(huán)境造成的污染，在頁(yè)巖油氣藏和致密油氣藏開(kāi)發(fā)過(guò)程中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

產(chǎn)低溫β-甘露聚糖酶的菌株O5提升低溫油藏壓裂液的破膠性能——摘要

產(chǎn)低溫β-甘露聚糖酶的菌株O5提升低溫油藏壓裂液的破膠性能——實(shí)驗(yàn)部分

產(chǎn)低溫β-甘露聚糖酶的菌株O5提升低溫油藏壓裂液的破膠性能——結(jié)果與討論、結(jié)論